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NRPB07S Ni-IDA瓊脂糖凝膠FF預裝柱

發布日期:2018-10-27 閱讀次數:274

品  名:Ni-IDA瓊脂糖凝膠FF

英文名:Nickel Iminodiacetic acid NUPharose Fast Flow,Ni-IDA NUPharose FF

目錄號:NRPB07L、NRPB07S(預裝柱)

規  格:20 ml,100 ml,1 L,1 ml預裝柱,特殊規格訂製

運  輸:2 ~ 30℃,常壓、避光

貯  存:20%乙醇,2 ~ 25℃

保質期:5年


相關介紹: 

鎳-瓊脂糖凝膠FF以瓊脂糖微球為基質,通過活化偶聯亞氨基二乙酸(IDA),再螯合Ni2+。其中IDA是金屬螯合層析中最常用的配體,與次氮基三乙酸(NTA)相比,具有親和力強,載量高,可再生重複使用的特點。

鎳-瓊脂糖凝膠FF主要用於純化帶組氨酸標籤(His-Tag)的重組蛋白。純化原理是利用重組蛋白組氨酸標籤的咪唑環可與過渡金屬Ni2+形成穩定的配位鍵,因此能特異、牢固、可逆地吸附於固定這些金屬離子的基質,結合了His-Tag重組蛋白的鎳-瓊脂糖凝膠FF一般通過增加咪唑濃度進行競爭洗脫。


技術指標:

基質

4%瓊脂糖凝膠

配基

-N(CH2COOH)2

配基密度

≥25 μmol/ml

填料粒徑

60 ~ 180 μm

最大流速

800 cm/h

推薦流速

50 ~ 100 cm/h

pH穩定性

pH 5 ~ 12pH 3 ~ 14(脫鎳)

耐反壓

0.3 MPa

載量

≥40 mg His-tag重組蛋白/ml 


使用方法:

1.色譜柱裝填

1.1 所有需要用到的材料的溫度要與色譜操作的溫度一至,液體最好做脫氣處理。

1.2 在柱子下端加入蒸餾水,以除去柱子中的空氣,關閉柱子出口,在柱內保留少量的蒸餾水。

1.3 將瓊脂糖凝膠連續倒入柱子時,要用玻璃棒的緊靠柱子內壁引流,以減少氣泡的產生,讓填料先自然沉降。

1.4 柱壓不超過0.3 MPa,如果裝柱系統中無法測柱壓,則控制流速高於300 cm/h,但是在使用中一般只用最大流速的75%。

1.5填裝好的鎳-瓊脂糖凝膠FF柱用2 ~ 5個柱體積的初始緩衝溶液平衡,建議流速100 cm/h,平衡后的柱子可以用於His-Tag重組蛋白的上樣和洗脫純化。

2.上樣

2.1 樣品一般溶解在pH6 ~ 8的初始緩衝液中,提高上樣緩衝液的pH值,可以增大載量。

2.2 緩衝液中不能含有EDTA和檸檬酸鹽,也最好不含巰基乙醇、DTT等還原劑。

2.3常用緩衝液有10 ~ 100 mM 磷酸鈉緩衝液、20 ~ 200 mM Tris-HCl緩衝液等。

2.4在緩衝液中一般要加入0.15 ~ 0.5 M的NaCl,以消除離子交換作用。

2.5在初次使用鎳-瓊脂糖凝膠FF,推薦使用50 mM PBS(50 mM NaH2PO4,0.5 M NaCl,NaOH調節pH 7.4)作為初始緩衝液。

3. 洗脫

3.1 鎳-瓊脂糖凝膠FF最常用的洗脫方法為增加咪唑濃度進行洗脫。

3.2咪唑為鹼性,相應緩衝液配製后需要用HCl進行調節pH。

3.3在初次使用鎳-瓊脂糖凝膠FF,不知道洗脫的咪唑濃度,推薦在初始緩衝液中分別加入10 mM、20 mM、50 mM、100 mM、200 mM、500 mM咪唑,濃度從低到高,分別洗脫和收集,通過SDS-PAGE電泳等方法鑒定。

3.4 有條件的也可以進行線性咪唑梯度洗脫,確定較佳洗脫條件。


拓展應用:

1. 更換不同的螯合離子

1.1 IDA螯合的鎳-瓊脂糖凝膠FF可以用EDTA脫掉鎳,脫掉鎳后可以用0.1 ~ 1.0M NaOH進行清洗凝膠,再重新螯合鎳,使凝膠煥然一新。也可以螯合其他金屬離子,如Cu2+,Zn2+,Co2+,Fe3+等,進行多樣純化。

1.2 脫鎳方法:用5 ~ 10個柱體積蒸餾水淋洗柱子,再用5 ~ 10個柱體積的100 mM EDTA淋洗柱子,再用2 ~ 3個柱體積的0.5 M NaCl洗掉殘留的EDTA。

1.3螯合金屬離子方法:用2 ~ 5個柱體積的蒸餾水充分平衡脫鎳的柱子,用0.1 ~ 0.3M金屬鹽溶液過柱5 ~ 10個柱體積螯合金屬,螯合後用5 ~ 10個柱體積蒸餾水淋洗,去除未螯合的金屬離子。

1.4 金屬鹽可以為硫酸鹽或鹽酸鹽,如為NiSO4、CuSO4、ZnSO4、CoCl2、PbSO4等,金屬鹽溶液應中性或弱酸性,且必須經過過濾,以防止金屬鹽在膠上沉澱。

1.5 如果是Fe3+必須在低pH下螯合(pH 3),以防止Fe3+產生沉澱,一般可以加入少量鹽酸和硫酸保持pH。

2. 多種洗脫方法

2.1 降低pH洗脫:大多數蛋白在pH 4 ~ 6會被洗脫下來,也可以在pH 3 ~ 4,緩衝液可以是醋酸鈉、檸檬酸或磷酸鹽緩衝體系。

2.2 競爭性洗脫:線性增加或一步增加與金屬離子有親和力的物質,如0 ~ 0.5 M咪唑,0 ~ 50 mM組氨酸,0 ~ 2 M NH4Cl。梯度洗脫最好在起始緩衝液的恆定pH下進行。

2.3 螯合劑洗脫:EDTA、EGTA等螯合劑會與金屬離子產生作用力,導致蛋白被洗脫下來。這種方法不能使不同的蛋白分離,此外會影響蛋白吸附,導致融合蛋白不能掛柱。

2.4 所有上述情況中,緩衝液中必須加入0.15 ~ 0.5 M的NaCl 以消除離子交換作用。

2.5 當螯合離子配基是Cu2+時,有以下的三種操作方式。

降低pH洗脫:

上樣緩衝液:50 mM NaH2PO4,0.5 M NaCl,pH 7.4

洗脫緩衝液:50 mM NaH2PO4,0.5 M NaCl,pH 3.5

競爭性洗脫:

上樣緩衝液:50 mM NaH2PO4,1 M NaCl,pH 7.4

洗脫緩衝液:50 mM NaH2PO4,1 M NH4Cl,pH 7.4

螯合劑洗脫:

上樣緩衝液:50 mM NaH2PO4,0.5 M NaCl,pH 7.4

洗脫緩衝液:50 mM NaH2PO4,0.5 M NaCl,50 mM EDTA,pH 7.4

註:配製的緩衝液需要用NaOH或HCl調節至要求的pH。使用降低pH和螯合劑洗脫會使金屬離子脫落,下次使用得重新螯和金屬離子,最常用的為競爭性洗脫。


再生、清洗:

1. 凝膠的再生

1.1 多次使用后或需要更換螯合的金屬離子,必須將膠脫鎳再生。脫鎳方法:用5 ~ 10個柱體積蒸餾水淋洗柱子,再用5 ~ 10個柱體積的100 mM EDTA淋洗柱子,再用2 ~ 3個柱體積的0.5 M NaCl洗掉殘留的EDTA。

1.2 多次使用的柱子脫鎳后一般需要清洗。清洗方法:用0.1 ~ 1.0 M NaOH反向清洗柱子,流速50 cm/h,保持1 ~ 2 h,能去除結合強的雜質,同時也能去除熱源。

1.3 清洗后需要重新螯合金屬離子。螯合方法:用2 ~ 5個柱體積的蒸餾水充分平衡脫鎳的柱子,用0.1 ~ 0.3M金屬鹽溶液過柱5 ~ 10個柱體積螯合金屬,螯合後用5 ~ 10個柱體積蒸餾水淋洗,去除未螯合的金屬離子。

2.在位清洗

2.1 除去因離子交換作用吸附的蛋白,用2 ~ 3個柱體積2 M 的NaCl溶液反向清洗柱子。

2.2 除去強的疏水性蛋白和脂質等,用4個柱體積的70%的乙醇或者30%的異丙醇反向清洗柱子。

2.3 除去蛋白沉澱、疏水性蛋白,參照凝膠的再生。


注意事項:

推薦流速

預裝柱體積

1 ml

5 ml

10 ml

流速(ml /min )

0.2

1

2